細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基本知識(shí)

一．細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞周期的測(cè)定

一、原理

    細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過(guò)兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使*終濃度為10μg/ml。

2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片（見(jiàn)第三部分：染色體技術(shù)）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)**、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9、計(jì)算： 細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。

  （2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉?2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

一、原理

   在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞*易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

二、操作步驟

（一）凍存

1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，**不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復(fù)蘇

1、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。

3、打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，**天觀察生長(zhǎng)情況。

三、試劑和器材

器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機(jī)等

試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）

附：凍存液配制：

培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

細(xì)胞系或細(xì)胞株的建立

一、概念

    1、細(xì)胞系（Cell Line）：原代培養(yǎng)舞經(jīng)**傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（Lineage of Cells）所組成。

    2、細(xì)胞株（Cell Strain）：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細(xì)胞株（finitecell strain）；如果可以連續(xù)傳代，稱為連續(xù)細(xì)胞株（continuous cell strain）。對(duì)于人類腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

   二、建立細(xì)胞系（或株）的要求

   什么樣的體外培養(yǎng)群可被認(rèn)可為己鑒定的細(xì)胞，視具體情況而定，無(wú)統(tǒng)一規(guī)定。對(duì)于用作原代培養(yǎng)的細(xì)胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長(zhǎng)期培養(yǎng)，特別是反復(fù)傳代的細(xì)胞，常需做如下說(shuō)明：

   1、組織來(lái)源：細(xì)胞供體所屬物種，來(lái)自人體或者動(dòng)物；

                個(gè)體性別、年齡；取材的器官或組織。

                如系腫瘤組織，應(yīng)說(shuō)明臨床和病理診斷，以及病歷號(hào)等。

   2、細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)：

   了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細(xì)胞一般形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和分裂指數(shù)，倍增時(shí)間，接種率等。

   如為腫瘤細(xì)胞，為說(shuō)明來(lái)源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對(duì)正常組織侵潤(rùn)力等實(shí)驗(yàn)。

   3、培養(yǎng)條件和方法；應(yīng)說(shuō)明細(xì)胞系（或株）適應(yīng)的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。

   三、若干細(xì)胞建株的要點(diǎn)及基本過(guò)程

   （一）腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)

   1、取材：材料主要來(lái)源于外科手術(shù)或活檢瘤組織，取材時(shí)避免用壞死組織，要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移**結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。

   2、成纖維細(xì)胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)能與瘤細(xì)胞同時(shí)生長(zhǎng)，并常壓過(guò)癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受阻以至消失，應(yīng)仔細(xì)排除。

   排除方法常有：機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

   3、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率

   根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。一般當(dāng)腫瘤組成或細(xì)胞被原代培養(yǎng)后，要經(jīng)過(guò)對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng)，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細(xì)胞底層等。用細(xì)胞生長(zhǎng)因子，根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如胰島素、氫化可的松，雌**等。也可以考慮動(dòng)物媒介培養(yǎng)。

  （二）人類**母細(xì)胞建株方法

   l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。

   2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml**細(xì)胞分離液的液面上靜置30min。

   3、1500rpm，15min，吸取白細(xì)胞層（**層）于另一離心管中。

   4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細(xì)胞兩次。

  5、將白細(xì)胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混勻。

   6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。

  7、1500rpm，15min。將細(xì)胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37℃培養(yǎng)。

   8、5天后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)情況，決定是否半量換液。一般半量換液l—2次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。

   9、待轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量明顯上升，并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊后，可轉(zhuǎn)入25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加1—2ml培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10—15天，一般每隔3—4天觀察一次，決定是否換液，傳代。

   10、細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后凍存，凍存前應(yīng)進(jìn)行核型分析和存檔。

個(gè)別組織細(xì)胞的培養(yǎng)

體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:

一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)

   上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

   體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng)，另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

   以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

   1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

   3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜。

   4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開(kāi)。

   5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

   6、反復(fù)吹打，制成懸液。

   7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸去上清。

   8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

   二、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮****、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。

研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法*為簡(jiǎn)便，其法如下：

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取10—15厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。

三、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

   神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)

組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

養(yǎng)方法如下：

1、從手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后，仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時(shí)腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。

3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。

4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)成紗布過(guò)濾，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長(zhǎng)后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

四、肌組織培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

（－）骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2、無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。

3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

  接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

該細(xì)胞接種率約50%，細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52小時(shí)后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象。

（二）心肌細(xì)胞培養(yǎng)

  心肌細(xì)胞是*早的培養(yǎng)材料，Carrel曾長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，*常用的是雞胚心肌。

  心肌比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時(shí)，一周后可見(jiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

五、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞屬**細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞**和分子**學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。

巨噬細(xì)胞也建有無(wú)限細(xì)胞系，大多來(lái)自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

  培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細(xì)胞，以小鼠腹腔取材法*為實(shí)用，其法如下：

1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)！），以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動(dòng)物于解剖臺(tái)，用針頭固定四肢，持鑷撕開(kāi)腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。

9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞，其中90%為巨噬細(xì)胞。

10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

六、腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank’s液的無(wú)菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng)，濾過(guò)組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)，去小組織塊，濾過(guò)物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過(guò)，Hank’s液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng)，離心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個(gè)/cm2，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天，去除腎小球未生長(zhǎng)組分，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞生長(zhǎng)成單層多角型細(xì)胞，直徑約100μm。

七、裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí)，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過(guò)程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞）來(lái)回推動(dòng)注射器吹打組織以分離單細(xì)胞，終止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。

二．細(xì)胞培養(yǎng)的基本內(nèi)容

常用設(shè)備

準(zhǔn)備室的設(shè)備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未**物品）、儲(chǔ)品柜（放置**過(guò)的物品）、包裝臺(tái)。

配液室的設(shè)備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測(cè)量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養(yǎng)室的設(shè)備：

液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無(wú)菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧****機(jī)、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。

無(wú)菌操作

無(wú)菌室的**：

1.定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3‰來(lái)蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過(guò)氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）**：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射

3.實(shí)驗(yàn)前**：打開(kāi)紫外燈、三氧**機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘

4.實(shí)驗(yàn)后**：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：

1.肥皂洗手。

2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋

3.用75％酒精棉球擦凈雙手。

無(wú)菌操作的演示：  

1.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過(guò)火**

4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和**

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自來(lái)水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)水沖洗15次，*后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過(guò)3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)和**閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉**閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。

7.高壓**后烘干

二、舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿可直接泡入來(lái)蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過(guò)來(lái)蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于**儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓**：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開(kāi)開(kāi)關(guān)和**閥，隨著溫度的上升**閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉**閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開(kāi)關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶**前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因?yàn)楦邏?*后器皿會(huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。

金屬器械洗消：

  金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）**，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來(lái)水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：

1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時(shí),或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘**，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。

2. 膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過(guò)的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內(nèi)高壓**，烘干備用。

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)（切記時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。*后裝入鋁盒內(nèi)高壓**，烘干備用。

4. 膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：

6.其他**方法：有的物品既不能干燥**，又不能蒸氣**，可用70％酒精浸泡**。塑料培養(yǎng)皿打開(kāi)蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線下**。也可用氧化乙烯**塑料制品，**后需要用2—3周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線**塑料制品效果*好。

為了防止清洗器材已**與末**發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否**。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC12?6H2o)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。

注意事項(xiàng)：

1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓**時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過(guò)多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏瑁瑫?huì)降低高壓**效果。檢查**閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。

2.安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過(guò)濾的作用。

3.注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。

細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與**

器材與試劑：

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。

具體步驟：

一. 水的制備：

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

二.PBS的制備與**(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待**：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅**20分鐘。注意高壓**后要用**蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

三. 胰蛋白酶溶液的配制與**：

  胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力*強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。

1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。

2.用注射濾器抽濾**：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾**。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

四.青、鏈霉素溶液的配制于**

1.     所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘**。

2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml**雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml**雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。

3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度*終為100單位/ml。1單位＝1微克？

五.RPMI1640的制備與**：

1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度*終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。*后定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待**。

3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾**。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。

六．血清的滅火：

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

七.HEPES溶液：

HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾**，分裝后4℃保存。

注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾**后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)**甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾**，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中*終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾**，分裝小瓶，保存溫度為?? ℃ 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（**可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和****。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾**。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明膠溶液：

因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，

注意事項(xiàng)：

1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值*終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）

具體操作：

一. 傳代前準(zhǔn)備：

1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

2.用75％酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。

3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

  5.準(zhǔn)備好將要使用的**后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次**。

6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

  7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

  8.打開(kāi)瓶口：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口**。

二.胰蛋白酶消化；

  1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞*好，*佳消化溫度是37℃。

  2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

  3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

三.吹打分散細(xì)胞：

1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。

   4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

四.分裝稀釋細(xì)胞：

   1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

   2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。*后要做好標(biāo)記。

五.繼續(xù)培養(yǎng)：

   用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。

傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

  1.嚴(yán)格的無(wú)菌操作

   2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓**，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。

細(xì)胞的復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

具體操作

一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

  3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二．取出凍存管：

  1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

  2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

三．迅速解凍：

  1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

  2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四.平衡離心：

   用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min

五.制備細(xì)胞懸液：

   1.吸棄上清液。

   2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

  細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細(xì)胞

  將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：

1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作：

一.準(zhǔn)備工作：    

   取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。

二.細(xì)胞懸液制備：

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。

三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

  2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

  3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

  4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

  5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝          （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)         ×2×104

說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

  1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；

  2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

  3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

  4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

  5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

五.初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

  1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

  2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

  3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：

4％臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過(guò)濾，4℃保存。

使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4％即可。

細(xì)胞的凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

3.置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。

4.置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。

5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng)：

1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓**，它本身就有**的作用。高壓**反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，故在配制時(shí)*好戴上手套操作。

2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。